La génétique

La génétique

EXTRACTION DE L'ADN 

 

  1. Les différentes origines de l'ADN

→ ADN des cellules eucaryotes, sur les chromosomes qui sont dans le noyau.

→ ADN des cellules procaryotes

→ ADN de phage, extraction après culture de bactéries infectées.

→ ADN de synthèse = fgmt courts synthétisés chimiquement

On distingue :

  • l'ADN chromosomique

  • l'ADN extra-chromosomique :

    • les plasmides ADN fréquemment contenu dans les bactéries, en plus de leur ADN génomique.

    • L'ADN mitochondrial

    • Les plastides : ADN chloroplastique des cellules végétales

  • L'ADN phagique.

 

  1. Extraction et purification de l'ADN chromosomique

    1. Principe :

L'ADN génomique total des cellules animales est obtenu en réalisant les étapes suivantes :

→ Lyse de la cellule grâce au SDS (qui désorganise la double couche de phos)

→ Dissociation des protéines histoniques sous l'action de protéinase K

→ Élimination du SDS et des protéines par lavages successifs

→ Précipitation de l'ADN génomique par l'éthanol

→ Élimination de l'ARN par une RNase

 

    1. Variantes :

→ des colonnes à usage unique, contenant un échangeur d'anions qui permet de retenir sélectivement l'ADN, sont commercialisées. L'ADN est retenu sur la colonne et les protéines sont éliminées par lavages. L'ADN est ensuite élué et éventuellement concentré par précipitation éthanoïque.

→ il existe des appareils automatisées pour extraire l'ADN

 

  1. Extraction et purification d'ADN plasmidique

L'ADN plasmidique, de faible masse moléculaire est important pour les expérimentations de génie génétique car réplication a lieu de façon autonome.

→ minipreps : obtention de petites quantités d'ADN à partir de colo bactérienne

→ midipreps : obtention de 500µg à 1mg d'ADN

→ maxipreps : obtention de plusieurs mg d'ADN plasmidique

    1. Principe :

→ culture de bactérie : réalisé en présence d'un atb sur milieu riche : car le plasmide possède un gène de résistance à l'atb utilisé et une origine de réplication donc seules ces bactéries pourront cultiver.

→ La lyse des bactéries réalisée par : Soit par Digestion enzymatique par lysozyme, par ébullition, soit en milieu alacalin avec du SDS ou par action du SDS en milieu non alcalin.

→ purification de l'ADN plasmidique (éliminer ADN chromosomique par du NaOH puis les protéine par centrifugation)

→ isoler l'ADN plasmidique :

  • par ultra-centrifugation en gradient de CsCl en présence de BET :

Le Bromure d'Ethinium se fixe sur l'ADN chromosomique mais pas sur le plasmidique. On observe le tube sous UV et on récupère l'ADN plasmidique à l'aide d'une seringue au travers de la paroi du tube de centrifugation.

  • par précipitation différentielle de l'ADN :

permet d'éliminer les fragments d'ADN et d'ARN résiduels.

  • Par Chromatographie échanges d'ions anioniques :

L'ADN plasmidique est absorbé de façon spécifique grâce à des conditions de pH et de force ionique appropriées. Il est ensuite élué en augmentant la force ionique.

 

  1. Extraction et purification de l'ADN phagique :

→ culture de bactérie infectée, puis lyse des bactérie.

→ précipitation des particules de phages

→ L'ADN de phage est précipité à l'éthanol

 

  1. Extraction d'ADN mitochondrial et des plastides :

→ peut être isolé de façon analogue par lyse et précipitation à l'alcool, après isolement des organites par centrifugation.

 

GENES ET MUTATIONS

 

Def : une mutation est une modification permanente du matériel génétique c'est-à-dire de l'ADN. Les mutations peuvent être causées :

  • par des agents physiques ou chimiques

  • par des erreurs lors de la réplications

 

  1. Types de mutations

→ Si la mutation implique un seul nucléotide (ou paire de bases) elle est dite ponctuelle. On distingue trois catégories de mutations ponctuelles :

  • la substitution : remplacement d'une base par une autre

    → si entre pyrimidine / ou entre purine = transition

    → si entre une pyrimidine et entre une purine = transversion

  • la délétion : perte d'une paire de base

  • l'insertion : introduction d'une paire de base supplémentaire

 

Conséquences :

  • substitution modifie le codon, qui correspondra à un nouvel acide aminé. Le cadre de lecture reste le même : mutation dite faux sens.

    Si le codon stop apparaît : mutation dite non sens.

  • Les délétions ou insertions provoquent un décalage du cadre de lecture. La séquence nucléotidique qui en résulte ne peut plus coder pour une protéine normale.

 

  1. Mutations dues à des modifications de bases, causées par des agents mutagènes

→ Ils peuvent modifier les bases et causer des mutations. Quand ils affectent les propriétés d'appariement d'une base, ils interfèrent avec la réplication ou la transcription. Ce sont des mutagènes. ( ils agissent par oxydation, hydrolyse, méthylation ou alkylation)

→ Les agents chimiques réagissant avec l'ADN modifie la structure de certains nucléotides ou les suppriment.

→ l’irradiation par les UV ou rayons X provoque l'altération qui modifie les nucléotides.

 

  1. Mutations ayant lieu au cours de la réplication

a. Incorporation de base incorrecte

Si l'erreur de mésappariement n'est pas détectée, la mitose suivante engendre une molécule normale dans une des cellules filles et une molécule mutée dans l'autre.

b. dérapage réplicatif

Si le brin formé se décale vers l'avant, une région non appariée demeure dans le brin d'origine, il en résulte une insertion. Si il se décale vers l'arrière, il en résulte une délétion.

 

  1. Conséquences

→ si mutation a lieu dans une régions non codante du gène = pas de conséquence : introns.

→ si dans une région codante : elle modifie le codon ou plus grave encore le cadre de lecture des codons. La modification d'un seul codon entraîne une maladie génétique grave.

→ si dans la protéine : l'aa correspondant au codon non muté peut être substitué par un autre, sans conséquence ( sans modification de structure ni du site actif)

→ si protéine avec modification : protéine anormale et perd son rôle biologique et une maladie apparaît (cause de nombreux cancers)

→ si mutations sur : promoteur : gène moins bien transcrit ou pas transcrit. Si enhancer : inhibiteur.

 

Mais une mutation permet l'évolution des formes de vies organisées !!

 

LES BANQUES D'ADN

 

Déf : c'est une collection de fragments d'ADN, dont l'ensemble représente le génome, c'est-à-dire tout l'ADN d'un organisme.

À partir d'une banque d'ADN on peut :

  • cloner un gène dont la position chromosomique est inconnue

  • caractériser une séquence

  • établir la carte physique d'une génome

  • séquencer à grandes échelles des portions ou la totalité d'un génome

 

  1. Les banques génomiques :

→ c'est un ensemble de vecteurs recombinants contenant chacun un morceau différent du génome de l'espèce.

→ les clones d'ADN génomiques sont les copies des fragments d'ADN provenant de tous les chromosomes de l'espèce étudiée. Ils contiennent des séquences codantes et des séquences non codantes.

 

  1. Les banques d'ADNc = complémentaire d'un ARNm

→ une banque d'ADNc est composée que des séquences codantes de l'ADN.

→ est représentative des populations d'ARNm présentes dans un tissu donné à un stade déterminé de son développement. Contrairement à la banque génomique, une banque d'ADNc sera spécifique d'un tissu.

La construction d'une banque d'ADNc :

  • extraction d'ARN

  • copie de ces ARNm en ADNc par une transcriptase inverse

  • Élimination spécifique des ARNm par la RNase ou la soude.

  • Synthèse du second brin d'ADN par une ADN pol

  • Fixation par une ligase d'oligonucléotide contenant un site de restriction

  • ligature dans un vecteur de clonage (plasmide ou phage)

  • intégration des vecteurs recombinants dans une bactéries afin de les multiplier

 

  1. Criblage d'une banque d'ADN :

Le criblage d'une banque génomique ou d'ADNc consiste à sélectionner spécifiquement des clones bactériens contenant la séquence du gène recherché.

 

Principe :

  • les bactéries qui ont été transformées par un vecteur peuvent former des colonies ou plages de lyse

  • réalisation d'une empreinte de culture sur nitrocellulose

  • lyse des bactéries

  • Dénaturation de l'ADN de la membrane

  • Identification de l'ADN du segment de gène recherché en l'hybridant avec une sonde marquée, après un signal apparaît sur la membrane, il indique la position du gène recherché.

  • Puis on fait multiplier les colonies portant ce gène

    1. Séparation des fragments :

Les molécules d'ADN porteuses de nombreuses charges négatives migrent dans le champ électrique vers l'anode. En passant au travers des mailles du gel, elles se séparent selon leur tailles : les molécules les plus grandes sont davantage retenues que les molécules plus petits qui de ce fait migrent plus vite et plus loins dans le gel.

    1. Détermination de la taille

La disatance de migration des fragments d'ADN est inversement proportionnel au log du nombre de bases, il est donc possible de déterminer leurs tailles en comparant leurs mobilités avec celles de fragments d'ADN de tailles connues (marqueurs de tailles)

    1. Estimation de la quantité d'ADN

il existe des marqueurs permettant d'estimer la quantité d'ADN bicaténaire

    1. estimation de la qualité de l'ADN

Si bande nette = ADN de bonne qualité.

Si bande diffuse flou = ADN contaminé par des protéines.

 

LA REPARATION DE L'ADN

 

On distingue :

  • les erreurs survenant lors des réplications (mésappariements..)

  • les effets des facteurs exogènes nocifs (UV, rayons gamma)

  1. Réparation par excision :

formation d'un dimère de thymine :

Irradiation par les UV à λ=260nm induit des liaisons covalentes entre deux thymines adjacentes (sur le même brin). Cela provoque une distorsion de l'ADN qui interfère avec la réplication et la transcription tant qu'il n'est pas réparé.

mécanisme réparateur :

  • le brin d'ADN porteur du dimère T-T est déformé. Il est reconnu par 3 protéines : les endonucléases XPA, XPB et XPC qui coupent le brin à deux endroits.

  • Une séquence de 27-29 nucléotides est supprimé par un complexe exonucléase

  • la brèche est comblé par la DNA pol I

  • la DNA ligase clôt la brèche

 

  1. Réparation des mésappariements :

corriger les erreurs de réplication :

  • le système de correction doit pouvoir distinguer le brin néo formé contenant la base erronée et le brin parental. L'enzyme de correction l'identifie en comparant les méthylations des A dans les séquences GATC. Le brin parental est méthylé en de nombreux sites alors que le brin fils n'est pas ou peu modifié car la méthylation n'est pas immédiate

  • enzyme de correction éliment le fragment d'ADN avec base incorrecte

  • DNA pol III comble la brèche

  • Trois protéines de réparations : hMSH1, hMLH1, hMSH2. Des mutations de leurs gènes entraînent des cancers.

 

  1. Réparation au cours de la réplication, de l'ADN endommagé par UV :

dommages de l'ADN interfèrent avec la réplication, les dommages sont réparés au cours de la réplication par le système protéique XPV

 

  1. Réparation double brin par recombinaison homologue :

les radiation gamma entraînent souvent des dommages double brins (cassures)

Les protéines qui assurent ces réparations sont codées par les gènes ATM, BRCA1 et BRCA2. Mutation de ces gènes => maladie graves :

  • l'ataxie telangiectasie (dilatation des vaisseaux sanguins)

  • prédisposition héréditaire au cancer du sein

LA REPLICATION DE L'ADN

 

INTRODUCTION :

la réplication (ou duplication) de l'ADN se produit pendant la phase S du cycle cellulaire (avant la mitose). La réplication dure 6 à 8 heures dans la cellules eucaryote. Quand les 46 chromosomes sont dupliqués, la mitose les répartit équitablement entre les deux cellules filles. Les protéines principales intervenant sont :

  • les hélicases : séparent les deux brins d'ADN pour former une fourche de réplication

  • les primases : initient la synthèse de la chaîne sur des sites préférentiels en synthétisant des amorces.

  • Les protéines d'initiation : reconnaissent le point d'origine de la réplication

  • les polymérases : qui réalisent la synthèse d'ADN d'après modèle

  • les protéines qui remanient la double hélice.

→ complexe entier : réplisome.

Chaque brin d'ADN sert de modèle pour la synthèse d'un nouveau brin : réplication semi-conservative.

PRINCIPE :

Elle débute en de nombreux points : origine de réplication qui forme chacun un réplicon.

→ la synthèse d'un brin d'ADN n'est possible que dans le sens 5' → 3' car un nouveau nucléotide ne peut se lier à l'extrémité 5'-P de la nouvelle chaîne synthétisée. Les nucléotides ne peuvent se lier, grâce à la DNA-pol, qu'un niveau de l'extrémité 3'-OH. C'est donc l'extrémité 3' qui s'allonge.

Mécanisme de la réplication :

→ La double hélice d'ADN doit être déroulée au niveau de chaque origine de réplication, grâce a des enzymes : DNA hélicases ou topo-isomérases. Les deux brins étant séparés sur ce site, une fourche de réplication se forme.

→ Les protéines de déstabilisation de l'hélice : elles redressent le brin matrice (parental) de l'ADN et facilitent l'action de la DNApol. Elles agissent aussi sur le brin tardif. Elles empêchent la formation de courtes hélices en épingle à cheveux.

les brins parentaux sont anti-parallèles donc:

- la réplication est continue sur un des deux brins, dit brin direct. Le brin néo-formé s'allonge par son extrémité 3', de façon continue, au fur et à mesure que la fourche progresse.

- Le long du brin 3' → 5', dit brin retardé, le nouvel ADN ne peut donc être synthétisé que par petites séquences de 1000 à 2000 nucléotides dits, fragments d'Okazaki.

→ La synthèse d'ADN, en continu sur le brin direct et celle des fragments d'Okazaki, est réalisée par la DNA polymérase III. Mais pour que cette enzyme puisse démarrer sa synthèse il faut qu'une RNA primase ait synthétisée une amorce d'ARN :

- sur le brin direct : une seule amorce suffit

- sur le brin retardé : il y autant d'amorce que de fragments d'Okazaki

→ La DNA polymérase I entre en action :

- détruit les amorces d'ARN

- comble les brèches en réalisant la synthèse des derniers segments d'ADN.

→ Les fragments d'ADN adjacents sont soudés grâce à l'action d'une DNA ligase.

→ Pendant la réplication, un mécanisme compexe de « correction des épreuves » supprime les bases incorporées à tort et les remplace par les bases correctes.

 

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