LA PCR

LA PCR : POLYMERASE CHAIN REACTION

 

Définition :

Technique permettant de multiplier des fragments définis d'ADN, indépendamment de tout système cellulaire (in vitro), en faisant intervenir des cycles successifs d'appariements spécifiques (avec une amorce) et d'élongation à l'aide d'une polymérase.

 

Principe de la PCR :

L'ADN à amplifier, qui doit avoir une taille maximal de 10kb est additionné :

  • des dNTP (désoxyribonucléotides triphosphate)

  • des amorces nucléotidiques (qui sont des ADN simple brin) complémentaires avec les séquences connues de chaque brin bornant l'ADN à amplifier. Les amorces doivent être :

    - choisies de façon à délimité la région ADN à amplifier

    - spécifiques des séquences complémentaires de l'ADN simple brin auquel elles vont s'apparier.

    - choisies de façon à minimiser les possibilité d'appariement entre elles cad éviter la formation de dimères « amorces sens/amorces anti-sens »

  • de la Taq polymérase, qui est une ADN polymerase thermostable extraite d'une bactérie thermophile : Thermus aquaticus

  • de MgCl2 : les ions magnésium sont nécessaires à l'activité de la Taq polymérase : cofacteur d'enzyme

  • un tampon déterminant pH et force ionique

Le mélange est placé dans un thermocycleur.

 

Phases de la PCR :

Dénaturation des brins d'ADN à amplifier, par chauffage à 95°C

Hybridation des amorces à une température comprise entre 50-55°C

Élongation par extension des amorces en aval de celle-ci à 72°C grâce à la Tad polymérase

puis à nouveau dénaturation et le cycle recommence.

 

Attention : l'héparine est un anticoagulant qui inhibe la Taq polymérase.
Donc ne pas utiliser de tube d'héparine si on doit réaliser une PCR sur un échantillon sanguin.

 

Contrôle de l'amplification :

par électrophorèse et une seule bande doit apparaître si la PCR est pure, car tous les fragments sont identiques donc migrent au même endroit.

 

Avantage de la PCR :

efficace, sensible et rapide

réaliser à partir d'une très petite quantité ou de matériel ancien.

Mais risque élevé de contamination !

 

LA PCR EN TEMPS REEL 
 

Principe :

Permet de suivre en direct l'amplification. La PCR en temps réel est basée sur l'utilisation d'un marqueur fluorescent (SYBRGREEN) au sein même de la réaction de PCR. Ce marqueur qui s'intercale dans l'ADN double brin émet une fluorescence après excitation par un faisceau laser. On détecte en temps réel l'augmentation de l'émission de la fluorescence qui est proportionnelle à la quantité d'ADN nouvellement formé à chaque cycle, elle-même proportionnelle à la quantité d'ADN dans le tube.

 

Phases :

phase de latence (peu de copie, donc signal faible)

phase exponentielle précoce

phase log-linéaire

phase finale en plateau (épuisement dNTP)

 

Quantification :

Le Cp correspond au nombre de cycle nécessaires pour que la fluorescence mesurée dépasse une valeur seuil fixée à partir de la ligne de bruit de fond.

Lorsque Cp est atteint, la quantité d'amplificats formés est la même pour toutes les PCR, mais le nombre de cycles nécessaire pour y arriver, est fonction de la quantité initiale No de cible à amplifier.

 

En quantifiant le nombre de copies, il est possible de mettre en évidence une délétion, une duplication, amplification de ce gène.

 

Limites de la technique :

confusions entre séquence d'ADN et d'éventuels dimères d'amorces

confusions éventuel d'ADN contaminant

Contrôle de pureté obligatoire : par dépôt sur gel, évaluation de la T° fusion Tm

Si le produit n'est pas pur, on observe au minimum 2 tracés possédant chacun sa valeur Tm ( selon la richesse en base GC :3H ou AT :2H ).

 

Application de la PCR :

maladies génétiques de l'embryon

empreintes génétiques

maladies infectieuses

étude oncogènes (cancérologie)

synthèse d'hormone par des MO

thérapie génique : greffe du gène normal

 

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